 Поліомієліт; Методичні рекомендації |
 |
Методичні рекомендації Вірусологічні лабораторії здійснюють моніторинг за циркуляцією вірусів поліомієліту серед населення країни та в об'єктах довкілля. Лабораторні вірусологічні дослідження дають можливість диференціювати випадки паралітичного поліомієліту та гострого в'ялого паралічу (ГВП), що спричинені іншими чинниками, у тому числі і ентеровірусами. Спостереження за циркуляцією поліовірусів в навколишньому середовищі та вивчення рівня колективного імунітету важливі для оцінки епідемічної ситуації з поліомієліту в країні та ефективності профілактичних заходів. Організація роботи вірусологічних лабораторій Якісна робота вірусологічних лабораторій можлива за умов стандартизації методів досліджень та забезпечення вірусологічних лабораторій відповідним обладнанням, культурами клітин та середовищами для них, діагностичними препаратами, реактивами тощо. Важливим є використання досвіду вірусологічних лабораторій інших країн, дотримання рекомендацій ВООЗ щодо методики проведення вірусологічних досліджень. Перелік необхідного обладнання: Вірусологічний бокс, термостат (33 град. - 38 град. С), СО2 - інкубатор. Для збереження культур клітин і вірусовмісного матеріалу - холодильник побутовий, холодильні камери на 20 - 40 град. C чи 70 град. C. Дистилятор, центрифуга, автоклав, сухожарова шафа. Посуд - флакони для культур клітин і взяття матеріалу з корками, що не мають токсичної дії, планшети 96-лункові для культур клітин, рН - метр, світловий мікроскоп, краще інвертований. I. Культивування та збереження клітинних культур Культури клітин При проведенні вірусологічних досліджень необхідно використовувати перещеплювані лінії клітинних культур НЕр-2 та RD, в окремих випадках, як виняток, культури Vero, Rh, Неlа, інші чутливі культури людського або мавп'ячого походження. Культура клітин НЕр-2 найбільш чутлива до поліовірусів і вірусів Коксакі В, RD - до вірусів Коксакі А, вірусів поліомієліту і ЕСНО. В кожній лабораторії рекомендується створити банк клітин, в якому клітинні лінії можуть зберігатися певний час без втрати їх життєздатності. Необхідність створення банку пояснюється тим, що чутливість культур клітин до поліо- та інших ентеровірусів при пасажах може знижуватися, не виключається також і можливість їх контамінації. Тому час від часу треба перевіряти чутливість культур до еталонних штамів, вірусів поліомієліту. Небажано проводити більше 20 - 25 пасажів. Після зазначеної кількості пасажів, зміні чутливості чи у випадку контамінації клітинних ліній необхідно повернутися до банку клітин. Забезпечення вірусологічних лабораторій культурами клітин НЕр-2 і RD здійснює Українська референс-лабораторія з поліомієліту (УРЛП). Середовища для культур клітин Робота з клітинними культурами може бути ефективною тільки за умов дотримання стерильності, якісної обробки посуду та використання поживних середовищ і збалансованих розчинів високої якості. Культивувати клітини можна на середовищах Ігла, Ігла МЕМ, 199 та інших. Якість свіжовиготовлених в лабораторії партій середовищ перевіряють при вивченні ефективності вирощування на них культур клітин, а також шляхом титрування відомого еталонного штаму вірусу в культурах клітин з таким середовищем. При відсутності токсичної дії середовища на клітини і відповідності титру вірусу відомим величинам середовище використовують для подальших досліджень. Поживні середовища можуть бути ростовими та підтримувальними. Ростові середовища, або середовища росту, містять до 10 % сироватки крові великої рогатої худоби чи ембріональної сироватки (сироватки повинні бути інактивовані і кожний флакон перевірений на стерильність та відсутність цитотоксичності). Середовища росту сприяють розмноженню клітин, їх швидкому росту і утворенню добре сформованих моношарів. Для репродукції в культурах клітин вірусів використовують середовища підтримки, які взагалі не містять сироватки, або в кількості не більше 2 %. Для успішного культивування клітин необхідно дотримуватися правил асептики, створювати умови, що перешкоджають росту бактерій та цвільових грибів. З цією метою доцільно використовувати антибіотики. Застосовують пеніцилін (натрієва сіль бензилпеніциліну) та стрептоміцин (хлор-кальцієвий комплекс), які вносять в поживні середовища безпосередньо перед вживанням: 100 ОД/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину. Можна використовувати також гентаміцин (200 ОД/мл), канаміцин та лінкоміцин (100 ОД/мл), неоміцин (50 ОД/мл), ністатин (50 ОД/мл) та інші. Культивування перещеплюваних культур клітин Перещеплювані клітинні культури вирощують у вигляді моношару на поверхні скла у флаконах, матрацах, пробірках. Для пересівання відбирають культури з чіткими межами між клітинами, що мають типову морфологію. Наявність у полі зору великої кількості округлих клітин, поява клітин з вакуолями та іншими ознаками патології робить дану генерацію непридатною для пересівання. У таких випадках для подальшої роботи використовують клітини з банку. Невелика кількість округлих клітинних елементів, які при незначному струшуванні змиваються з поверхні моношару, не є перешкодою їх використання для вірусологічних досліджень чи для подальшого перещеплювання. Під час росту клітин (після другої - третьої доби) спостерігається зміна рН у кислий бік, при цьому іноді частина клітин відривається від поверхні скла і потрапляє в поживне середовище. Зміна рН в кислий бік, що наступила на першу - другу добу після пасажу клітин та помутніння середовища також можуть бути пов'язані з контамінацією мікроорганізмами. З такою культурою працювати не можна, слід повернутися до банку клітин. Вибрану для пересівання культуру клітин знімають з поверхні скла за допомогою трипсину (0,25 %) або версену (0,02 %). Після дворазового відмивання моношарів невеликою кількістю розчину трипсину чи версену їх вміщують в термостат на 10 - 15 хвилин, після чого до клітин додають невелику кількість середовища росту. Ним старанно змивають клітини зі скла. Одержану суспензію клітин після підрахунку в лічільній камері розводять середовищем росту до концентрації, необхідної для посіву. У флакони об'ємом 100 мл розливають по 20 мл суспензії, що містить 40 - 60 тис. клітин в 1 мл, у матраци об'ємом 1,5 л вносять по 150 мл суспензії, в 1 мл якої міститься 60 - 70 тис. клітин. У пробірки вносять по 180 - 300 тис. клітин в об'ємі 1 мл. Формування моношару відбувається за 48 год. З метою запобігання контамінації культури клітинами іншого походження не дозволяється у культурному боксі одночасно працювати більше ніж з однією лінією клітинних культур. Створення банку клітин Отримані в Українській референс-лабораторії клітини тричі перещеплюють, заморожують і зберігають при t -70 -40 град. C або в умовах рідкого азоту, дотримуючись правил кріоконсервування. 1. Кріоконсервування (замороження) клітинних культур На першому етапі отримують суспензію клітин за допомогою трипсину або версену (див. вище). Далі суспензію центрифугують при 1000 - 2000 об./хв. 10 хвилин, зливають надосадову рідину. Ресуспендують клітини в середовищі для заморожування так, щоб кінцева концентрація була не менша за 10 в ступ. 7 клітин/мл. З цією метою можна використовувати 2 типи середовищ для заморожування: - ростове середовище +10 % ДМСО (диметилсульфоксид), - ростове середовище +10 % стерильного гліцерину, нетоксичного для клітин. Клітинну суспензію розливають по 1 мл в пробірки для заморожування з кришками, що загвинчуються, або в ампули, відмічають дату, тип клітин, номер пасажу та прізвище відповідальної особи. Пробірки вміщують у пенопластові контейнери, які дозволяють охолоджувати клітини з постійною швидкістю і зберігають в холодильнику при -70 град. C. Термін збереження життєздатності культур клітин при -70 град. C складає близько року, іноді й більше, хоча частина популяції клітин при цьому втрачає життєздатність. При -40 град. C можна зберігати клітини протягом 0,5 року. В рідкому азоті час зберігання клітин необмежений. 2. Поновлення заморожених культур клітин Пробірку із замороженими клітинами вміщують у полиетиленовий пакет і швидко розморожують у водяній бані при 36 град. C протягом 3-х хвилин. Після цього протирають поверхню пробірки 70 % етанолом, обережно відкривають пробірку в боксі. Для зменшення токсичної дії консервантів (ДМСО чи гліцерину) в пробірку з клітинною суспензією поступово по краплям додають 1 - 2 мл поживного середовища, постійно - струшуючи вміст пробірки. Після цього негайно центрифугують клітини при 1000 - 2000 об./хв. протягом 3 - 4 хвилин. Зливають надосадову рідину, яка містить консервант. Відмиті клітини ресуспендують в середовищі росту до кінцевої концентраціі 40 - 60 тис. клітин/мл і заливають в порожній посуд, що призначений для культивування культур (флакон, матрац). Наступного дня, коли клітини починають формувати моношар, перевіряють їх якість і замінюють середовище росту на свіже, щоб видалити залишки консерванту і нежиттєздатні клітини. II. Титрування вірусів у культурах клітин Титрування вірусів у культурах клітин за цитопатичною дією (ЦПД) Метод титрування вірусу за ЦПД грунтується на визначенні найбільшого розведення вірусвмісного матеріалу, в якому вірус може спричинити ЦПД у 50 % інфікованих культур клітин. Ця величина називається 50 % тканинною цитопатогенною дозою (ТЦД50). Для титрування вірусів спочатку проводять звільнення внутриклітинного вірусу і очищення вірусвмісного матеріалу від клітинного детриту шляхом його заморожування та розморожування з подальшим центрифугуванням при 1000 - 2000 об./хв. протягом 3 - 5 хв. Для інфікування культур клітин готують десятиразові розведення досліджуваного вірусвмісного матеріалу, використовуючи стерильні сольові розчини (фізіологічний розчин, розчин Хенкса тощо). Розведення краще готувати в стерильних флаконах від пенициліну. Для отримання кожного наступного розведення слід міняти піпетки (наприклад, стерильною кінцевою піпеткою вносять у першу пробірку 1,8 мл сольового розчину і 0,2 мл вірусвмісного матеріалу - отримали розведення 10 - 1; другою стерильною піпеткою перемішують рідину і переносять 0,2 мл до другої пробірки - отримали розведення 10 - 2 і так далі). Титрування здійснюють у чутливих культурах клітин, які сформували за добу добрий моношар на стінці пробірок або флаконів від пеніцілину. З пробірок чи флаконів з культурою клітин видаляють середовище росту і вносять по 0,1 мл вірусвмісного матеріалу на пробірку (0,2 мл на флакон). На кожне розведення вірусу використовують 4 пробірки (флакони) з культурою клітин. Починають інфікування культур з кінцевого розведення вірусу, у цьому разі зникає потреба щоразу міняти піпетки. Потім до кожного моношару клітин додають середовище підтримки. Інфіковані та контрольні культури вміщують у термостат і витримують при температурі 36 град. С. Результати визначають на 3 - 5 добу. Інтенсивність ЦПД оцінюють за системою плюсів (4+). Далі проводиться статистична обробка за методом Ріда-Менча або за формулою Кербера. Визначається ТЦД50 в об'ємі матеріалу, взятого для зараження одного моношару з культурою клітин. Роблять перерахунок по визначенню ТЦД50 на 1 мл вірусвмісного матеріалу. Формула Кербера для визначення титру вірусу: 1g ТЦД50 = L - d(S - 0,5), де L - 1g найменшого розведення, яке використане у титруванні; d - інтервал у 1g між двома послідовними розведеннями; S - сума пропорцій позитивних тест-одиниць (тобто пробірок з культурою, де з'явилася ЦПД) у кожному розведенні. Приклад:
1g ЦД50 = -1-1(3,75-0,5) = -4,25 Титр вірусу = 10 4,25/0,1 мл У деяких випадках замість 4-х пробірок на одне розведення вірусу припустимо використання лише 2-х пробірок, при цьому точність підрахунків дещо знижується, хоча й залишається достатньою для подальших досліджень. Титрування вірусів у культурі клітин за методом бляшкоутворення під бентонітовим покриттям Цей метод грунтується на здатності цитопатогенних вірусів до локального руйнування клітинного моношару, покритого поживним середовищем, що містить бентоніт. Вірусна 6ляшка є наслідком деструкції клітин потомством однієї вірусної частки. Бляшки вірусів мають вигляд округлих прозорих плям на неушкодженому фоні моношару, покритому бентоніном. Феномен бляшкоутворення отримують таким чином: вірусвмісним матеріалом інфікують чутливі перещеплювані культури клітин, що вирощені в невеликих матрацах, на дні колбочок Ерленмейера або флаконів з-під пенициліну об'ємом 10 - 20 мл. Після адсорбції вірусів (через 30 - 40 хв.) інфіковані моношари заливають поживним середовищем, що містить гель бентоніту. Під шаром бентоніту в поживному середовищі клітини зберігають життєздатність протягом 4 - 6 діб. Через 1,5 - 2 доби після інфікування з'являються вірусні бляшки. Інфекційність вірусів виражають в бляшкоутворюючих одиницях (БУО/мл). Для одержання ефекту бляшкоутворення доцільно використовувати ті самі клітинні культури, що й для виділення вірусів - негусті моношари 1 - 2 добового формування. Склад поживного середовища з гелем бентоніту для виявлення вірусних бляшок:
Приготування середовища покриття з гелем бентоніту До стерільної бідистильованої води у флаконі об'ємом 500 мл додають 5 мл гелю бентоніту. Суміш інтенсивно струшують, щоб одержати дрібнодисперсну суспензію часток сорбенту. Потім послідовно додають вищезгадані компоненти. Замість 10-кратного розчину Ерла можна використовувати однократний. У такому випадку згадані компоненти, за винятком бідистильованої води, додають безпосередньо до цього розчину. Важливо старанно диспергувати бентоніт в розчині Ерла шляхом інтенсивного струшування. Оптимальні значення pH бентонітового покриття 8,0 - 8,2. Методика титрування вірусів за бляшкоутворенням Вірусовмісний матеріал розводять десятиразово у стерильному сольовому розчині. Відбирають флакони із сформованим моношаром клітинних культур, видаляють з них поживне середовище і вносять на моношари флаконів від пеніциліну або колбочок Ерленмейєра відповідно по 0,2 та 0,5 мл матеріалу кожного розведення, починаючи з найвищого. Рівномірно розподіляють вірусовмісний матеріал по поверхні моношару. Адсорбація вірусів на клітинах відбувається при температурі 36 град. C протягом 30 - 40 хвилин. Після цього моношари відмивають стерильним сольовим розчином і вносять поживне середовище з бентонітом в об'ємі 3 - 5 мл для моношарів клітин, що вирощені на дні флаконів від пеніциліну, і 10 - 15 мл для невеликих матрасів або колбочок Ерленмейєра на 50 мл. Інфіковані флакони витримують при температурі 36 град. C. Облік здійснюють через 48 годин. Титр вірусу обчислюють в БУО/мл вірусвмісного матеріалу. В таблиці 1 наведений приклад розрахунку титру вірусу в БУО/0,2 мл (використовували флакони від пеніциліну з моношарами клітин, на кожний моношар вносили по 0,2 мл розведеного вірусу). Приклад розрахунку титру вірусу
Визначають середню арифметичну величину від усереднених титрів для всіх розведень з урахуванням об'єму досліджуваної рідини, яку вносили на моношар.
5
6 де 5 - коефіцієнт перерахунку об'єму на 1 мл,
5 3 - кількість спостережень, (3,2 + 5,0 + 5,0) - усереднена кількість бляшок при екстраполяції на однакове розведення (10 - 5). III. Ідентифікація ізольованих штамів ентеровірусів Ідентифікація ентеровірусів у реакції віруснейтралізації по пригніченню цитопатогенної дії. Реакція нейтралізацій (РН) грунтується на властивостях імунної сироватки блокувати здатність вірусу репродукуватися в культурі клітин і не викликати ЦПД чи утворення бляшок. Це є наслідком взаємодії нейтралізуючих антитіл з поверхневими антигенами віріону, що відповідають за його адсорбцію на клітині. За певних умов віруснейтралізуючі антитіла здатні також руйнувати віріони. РН може бути застосована як для ідентифікації виділених ентеровірусів, так і для виявлення рівня антитіл у сироватці людини. Ідентифікація виділених з клінічного матеріалу ентеровірусів здійснюється в реакції нейтралізації з використанням відомих діагностичних ентеровірусних імунних сироваток. Тип вірусу визначають по типу сироватки, що його нейтралізувала. Для реакції нейтралізації використовують стандартні комерційні набори діагностичних полі- та моновалентних сироваток. При проведенні реакції беруть однакові об'єми дози вірусу (100 ТЦД50) і діагностичної сироватки, у робочому розведенні якої не менше 20 нейтралізуючих одиниць. Підготовку сироваток та ідентифікацію вірусів слід проводити згідно з інструкцією, що додається до набору. Через те, що рід ентеровірусів представлено значною кількістю серологічних типів, доцільно під час типування використовувати суміш діагностичних сироваток проти різних типів вірусів поліомієліту, Коксакі та ЕСНО (схема Лім, Беньяш-Мельник). У таблиці 2 наведено склад сумішей для типування 42 типів ентеровірусів. Склад сумішей імунних сироваток для типування ентеровірусів
Якщо штам вірусу цими сумішами не нейтралізується, проводять РН з імунними сироватками до інших ентеровірусів. Робочі розведення виділеного штаму ентеровірусів готують, виходячи з його титру, таким чином, щоб у 0,1 мл кінцевого розведення містилося 100 ТЦД50 (або 100 БУО) вірусу. Кількісне співвідношення інгредієнтів для розведення вірусвмісного матеріалу наведено в табл. 3. Співвідношення інгредієнтів для розведення вірусомісного матеріалу
Приклад. Вихідний титр вірусу 10 6,3 ТЦД50/мл, або 10 5,3 ТЦД50/0,1 мл. Доза, необхідна для РН (1000 ТЦД50/0,1 мл), міститься у розведенні 10 - 3,3. Готують три послідовних 10-кратних розведення, останнє з яких розводять ще двічі, оскільки антилогарифм 0,3 = 2. Розведення діагностичних імунних сироваток та приготування їх сумішей здійснюють згідно з інструкцією, до кінцевої концентрації 20 нейтралізуючих одиниць (тобто у 20 разів більше, ніж треба для нейтралізації 100 ТЦД50 вірусу) кожної сироватки. У цьому разі враховують вихідний титр сироватки або її робоче розведення, зазначені на етикетці ампули. Для постановки РН готують нейтралізаційні суміші, до складу яких входять рівні об'єми вірусвмісного матеріалу в робочому розведенні (100 ТЦД50 вірусу в 0,1 мл) і сироватки кожного типу (чи сумішей діагностичних сироваток). Нейтралізаційні суміші витримують протягом години при температурі 36 град. С, вносять по 0,2 мл кожної суміші (0,1 мл вірусу + 0,1 мл сироватки) в 4 пробірки (флакони) з 24 - 48- годинною моношаровою культурою клітин. Через 40 - 60 хвилин інкубації при 36 град. C додають середовище підтримки в певному об'ємі (в залежності від площі моношарів). Паралельно ставлять контролі: - дози вірусу для визначення фактичної кількості ТЦД50, що бере участь у реакції: моношари клітин інфікують робочим розведенням, а також розведеннями, які містять 10 ТЦД50 та 1000 ТЦД50; - робочого розведення сумішей діагностичних сироваток з метою виявлення можливої неспецифічної цитопатичної дії; - культури клітин. Пробірки (флакони) розміщують в термостаті при 36 град. C і ведуть спостереження, починаючи з другого дня, протягом 3 - 5 діб. Облік результатів РН проводять, починаючи з оцінки стану контролів, які повинні бути такими: моношари неінфікованих культур залишаються незміненими до кінця експерименту (контроль клітин); типоспецифічні імунні сироватки (суміші) не спричиняють цитотоксичної дії (контроль сироваток), робоча доза вірусу визначена вірно. Тип виділеного вірусу визначається за спільним компонентом імунних сироваток, що входять до складу сумішей, які нейтралізують його інфекційну активність (табл. 4). Визначення типу ентеровірусів за результатами реакції нейтралізації
Приклад. Виділений цитопатичний вірусний штам нейтралізується сумішами B і E. До складу сумішей входять імунні сироватки до таких типів ентеровірусів:
Нейтралізація досліджуваного вірусу одночасно двома сумішами B і E дає змогу зробити висновок, що досліджуваний вірус є вірусом поліомієліту 2 типу (табл. 4). Інколи для ідентифікації вірусу, виділеного з матеріалу від хворого з підозрою на ентеровірусну інфекцію, реакцію нейтралізації можна проводити в два етапи: замість 8 сумішей імунних сироваток (табл. 2) можна використовувати полівалентні поліо-, Коксакі A, B та ЕСНО антивірусні сироватки. У разі нейтралізації вірусу однією з цих сумішей проводять нейтралізацію з використанням монорецепторних поліо-, Коксакі-, або ЕСНО- антивірусних сироваток. Ідентифікація ентеровірусів у реакції віруснейтралізації за редукцією бляшкоутворення під бентонітовим покриттям Постановка PH проводиться з використанням тих самих ентеровірусних діагностичних сироваток, що і для PH за пригніченям ЦПД. Суть методу полягає в поєднанні виділеного вірусу з відповідною кількістю типоспецифічної діагностичної сироватки (чи суміші) і спостереженні за редукцією бляшок під бентонітовим поживним покриттям. Про відповідність штаму вірусу одній із сироваток свідчить пригнічення репродукції вірусу і, відповідно, відсутність бляшок на моношарі клітин. Для постановки PH за редукцією бляшкоутворення під бентонітовим покриттям використовують виділені штами вірусів у робочій дозі 50 - 100 БУО в 0,1 мл. Суміші діагностичних сироваток (склад сумішей див. табл. 1), готують так, щоб у кінцевому розведенні в 0,1 мл містилося не менше, як 20 віруснейтралізуючих одиниць кожної сироватки. У пробірці поєднують однакові об'єми однієї із сумішей діагностичних імунних сироваток і робочого розведення вірусу, інтенсивно струшують і витримують в термостаті при 36 град. C протягом 1 год. Такою сумішшю інфікують моношари (по 2 - 4 моношари на кожну суміш). Бажано використовувати ту культуру клітин, на якій було виділено даний штам вірусу. Через 40 - 60 хвилин контакту суміші з моношарами (період адсорбції вірусу) флакони заливають бентонітовим поживним покриттям (3 - 4 мл на флакон від пеніциліну). Паралельно контролюють сироватки на цитотоксичність і робочу дозу вірусу. Результати PH оцінюють через 36 - 48 год. інкубації в термостаті при 36 град. C. При позитивних результатах PH відмічається відсутність бляшок або зниження їх кількості на 80 % у порівнянні з контролем вірусу (50 - 100 БУО/0,1 мл). Тип вірусу визначається по табл. 4. Ідентифікація штамів поліо- та інших ентеровірусів за альтернативним методом (мікрометод, рекомендований ВООЗ) Постановка реакції здійснюється в спеціальних 96-луночкових мікроплатах для культур клітин з плоским денцем. Для постановки реакції віруснейтралізації можна користуватися тими самими діагностичними сироватками, що і для постановки реакції макрометодом в пробірках, флаконах. Використовують середовище, яке містить 2 % ембріональної сироватки, культури клітин НЕр-2, RD. Готують розведення діагностичних сироваток згідно з доданим настановленням і вносять по 50 мкл кожної сироватки (суміші) в 4 лунки. Паралельно здійснюють контрольне титрування вірусу (визначення титру вірусу). Для цього готують серії десятиразових розведень вірусу від 10 в ступ. -1 до 10 в ступ. -7 в об'ємі 1 мл (0,9 мл середовища +0,1 мл вірусу) за винятком розведень 10 в ступ. -3 і 10 в ступ. -4, де об'єм повинен становити 2,0 мл (1,8 мл середовища + 0,2 мл попереднього розведення вірусу). Для контрольного титрування використовують розведення від 10 в ступ. -7 до 10 в ступ. -3, для досліду беруть по 50 мкл кожного 40 розведення у 4 повторах. Титр вірусу визначають за Ридом-Менчем або а Кербером (див. вище). Для постановки реакції віруснейтралізації використовують розведення 10 в ступ. -3 та 10 в ступ. -4 (близько 100 ЦПД50 в 50 мкл): у дві лунки з відповідною сироваткою чи сумішшю сироваток додають по 50 мкл розведення 10 в ступ. -3, а у дві інші - 50 мкл розведення 10 в ступ. -4. У 4 лунки для контролю клітин вносять по 100 мкл середовища. В усі лунки контрольного титрування також додають по 50 мкл середовища. Загальний об'єм у всіх лунках повинен бути однаковим. Мікроплату закривають кришкою і інкубують при 36 град. C протягом 1 години. Після цього в усі лунки додають по 100 мкл суспензії клітин (HEp-2, RD), що містять 150000 клітин в 1 мл, заклеюють плату спеціальною плівкою і інкубують її в СО2-інкубаторі при 36 град. С. Мікроскопують за допомогою інвертованого мікроскопу і записують результати щоденно, облік результатів закінчують через 24 години після виявлення 100 % ЦПД у лунках контролю вірусу. Якщо титр вірусу дорівнює 10 4,5 - 10 6,5 ТЦД50 (тобто 100 ТЦДЦ50 +- 0,5 lg в 50 мкл, що відповідає робочій дозі вірусу 10 в ступ. -3 - 10 в ступ. -4), то можна оцінювати реакцію віруснейтралізації. Якщо титр вірусу менший або більший, необхідно повторити типування з правильно підібраною дозою вірусу. IV. Серологічні методи дослідження Серологічні методи дослідження проводяться з метою визначення рівня антитіл до поліовірусів у сироватках крові хворих або для оцінки стану популяційного імунітету населення до поліомієліту. Виявлення сероконверсії (приросту титру антитіл в 4 і більше рази) в сироватці хворого є додатковим підтвердженням діагнозу захворювання з урахуванням комплексу клінічних, вірусологічних та епідеміологічних даних. Для виявлення сероконверсії використовують парні сироватки, першу з яких бажано взяти на 2 - 4 добу хвороби, другу - через 2 - 3 тижня. При необхідності досліджують і третю сироватку крові. Для визначення рівня гуморального імунітету відбирають тільки одну сироватку. Для отримання сироватки бажано відібрати 3 - 5 мл крові. Пробірку з кров'ю залишають на 2 години при кімнатній температурі. Утворений згусток відокремлюють від стінок пробірки стерильною скляною паличкою або пастерівською піпеткою. Прискорення ретракції згустка крові та збільшення виходу сироватки відбувається, якщо далі кров витримують у холодильнику при температурі 0 - +8 град. C протягом 18 - 24 год. Відокремлену від згустка сироватку центрифугують протягом 10 хв. при 1500 об./хв. для видалення рештки домішок клітин крові. Частину сироватки досліджують, решту зберігають у замороженому стані. Якщо досліджуються парні сироватки, то першу сироватку зберігають до моменту отримання другої. В подальшому їх досліджують одномоментно. Якщо у дитини неможливо взяти кров із вени, її можна отримати із пальця. Мінімальна кількість сироватки, що необхідна для дослідження, становить 0,1 мл. З пальця можна одержати 0,3 - 0,4 мл крові, яку збирають у невеличку стерильну ємність, без антикоагулянтів або консервантів. Сироватку від згустка відокремлюють, як позначено вище. Як вже відмічалось, РН грунтується на специфічній взаємодії антитіл сироватки хворого чи вакцинованої особи з еталонним вакцинним або аутоштамом поліовірусів з наступною нейтралізацією інфекційної активності вірусу (відсутність ЦПД чи бляшок при відповідних контролях). При постановці РН з метою серологічної діагностики беруть постійну дозу вірусу (100 ТЦД50 або 100 БУО в 0,1 мл) і послідовні 2-разові розведення досліджуваних сироваток крові. Дослідження необхідно проводити з вакцинними штамами вірусу поліомієліту типів 1, 2 та 3, які можна одержати в Українській референс-лабораторії з поліомієліту. Проведення реакції з використанням еталонних вірулентних штамів поліовірусу суворо забороняється. Еталонні вакцинні штами напередодні постановки РН титрують на тих клітинах і за такою ж методикою, як далі буде проводитись постановка РН. Методика постановки РН з метою серологічної діагностики поліомієліту за пригніченням ЦПД Для звільнення сироваток крові від термолабільних інгібіторів їх прогрівають при 56 град. C протягом 30 хв. (слід враховувати, що така теплова обробка призводить до зменшення титру антитіл класу IgM). Потім готують розведення парних сироваток крові з 2-кратним інтервалом від 1:4 до 1:512 - 1:1024, і кожне розведення, починаючи з останнього, після ретельного перемішування вносять по 0,4 мл у 3 простерилізовані пробірки. У пробірки з розведеннями сироваток додають по 0,4 мл розведення вакцинного штаму поліовірусу відповідного типу, що містить 100 ТЦД50. Суміші вірусів з різними розведеннями сироватки крові струшують і витримують при температурі 36 град. C протягом 1 год. Кожну суміш вносять по 0,2 мл у 2 - 4 пробірки (флакони) з 24 - 48- годинною моношаровою культурою чутливих клітин, попередньо видаливши з неї середовище росту. (При недостатній кількості сироватки крові нейтралізацію з вірусом кожного типу ставлять в одному ряді розведень.) Інфіковані моношари інкубують при 36 град. C протягом 30 - 60 хвилин, після цього заливають середовище підтримки. Паралельно ставлять контролі: 1) Контроль дози вірусу для визначення фактичної кількості ТЦД50, що бере участь у реакції: по 4 пробірки з моношаром клітин інфікують вірусом, взятим у робочому розведенні (100 ТЦД50 у 0,1 мл), а також у трьох зменшених розведеннях, які містять 10 ТЦД50, 1 ТЦД50, 0,1 ТЦД50 вірусу. 2) Контроль сироваток на цитотоксичність: 0,1 мл найменшого розведення (1:4) кожної сироватки крові наносять на моношар з культурою клітин. 3) Контроль культури клітин - для виявлення можливої неспецифічної ЦПД. Для цього залишають незараженими 4 моношари культур клітин, які інкубують при температурі 36 град. C протягом 5 - 7 діб. PH за редукцією вірусних бляшок здійснюється за такою ж методикою, з використанням чутливих культур клітин, що виросли на дні флаконів від пеніциліну, та бентонітового покриття. Враховують результати PH, починаючи з контролів. Потім оцінюють результати в дослідних пробірках чи флаконах. Затримка ЦПД вірусу свідчить про наявність антитіл у сироватці крові. В PH по редукції бляшкоутворення позитивним вважається результат, коли спостерігається повна відсутність чи зниження на 80 % кількості бляшок при повноцінному контролі вірусу (5 - 100 бляшок). Діагностичне значення має 4-разове зростання титру антитіл у другій сироватці. Серологічні дослідження можуть надати допомогу при підтвердженні діагнозу поліомієліту, але згідно з рекомендаціями ВООЗ їх не можна вважати головним діагностичним критерієм. Ці дослідження не дозволяють відрізнити інфікування диким поліовірусом від нормальної реакції на вакцинацію проти поліомієліту. Особливе значення серологічні дослідження мають для оцінки стану колективного імунітету до поліовірусів. V. Вірусологічна діагностика поліомієліту та інших ентеровірусних інфекцій Взяття і доставка матеріалу Лабораторну діагностику поліомієліту необхідно проводити шляхом виділення вірусів з фекальних проб хворого з використанням культури клітин. Забір проб необхідно проводити якомога швидше - в перші 14 діб (а краще протягом перших днів) після появи паралічів. У цей період кількість вірусів у фекальних масах досягає найвищих рівнів. У зв'язку з тим, що виділення вірусів з фекальних мас не носить постійного характеру, проби треба відбирати двічі: перша проба - в день обстеження хворого, друга проба - через 24 - 48 годин після забору першої проби. Змиви з ротоглотки менш ефективні для виділення поліовірусів (лише у перші 7 - 10 днів після початку хвороби). Незважаючи на нейротропізм поліовірусів, вони рідко виділяються із спинномозкової рідини, у той час, як інші ентеровіруси можуть бути ізольовані з ліквору з високою частотою. Усі проби для виділення вірусів повинні бути взяті у найбільш ранні терміни після початку захворювання. У летальних випадках секційні проби слід взяти у перші години після смерті. Усі проби для виділення вірусу необхідно брати дуже обережно, щоб виключити можливість контамінації однієї проби вірусом з іншої проби. В осередку інфекції відбирають по одній пробі фекальних мас від кожного з 5 контактних дітей віком до 5 років. Доцільно обстежувати осіб, які могли спілкувались з хворим: друзів по дитячих іграх, однокласників, братів та сестер. Збір матеріалу від осіб, що спілкувалися, і у випадках, коли від початку паралічу пройшло більше 6 тижнів, але матеріал не було зібрано, а також у випадках смерті хворого. Якщо від початку паралічу пройшло більше 3 місяців, досліджувати матеріал від осіб, що спілкувалися з хворим, недоцільно. Для вірусологічних досліджень збирають проби фекальних мас вагою 8 - 10 грамів. Ця кількість матеріалу дозволить при необхідності провести повторні дослідження. Проби розміщують у спеціальних контейнерах з кришками, що загвинчуються, чи іншому стерільному посуді (скляному або пластмасовому). На пробі вказують прізвище пацієнта, реєстраційний номер випадку, дату взяття матеріалу. Пробу відразу ж вміщують у холодильник з температурою 0 - +8 град. C. На кожного обстеженого оформлюється направлення на лабораторне дослідження, яке повинно знаходитись окремо від проби (додаток 1). Його не слід обгортати навколо проб чи класти у холодильник. Для транспортування проби треба загорнути у гігроскопічний матеріал, запакувати у пластиковий пакет і розмістити в контейнері з термоізоляційним шаром і холодовими елементами. Усі бланки з даними, що мають відношення до проб, треба покласти в конверт, зазначити на ньому дату відправлення, помістити в окремий поліетиленовий пакет і покласти в контейнер. Якщо очікується, що період часу між взяттям проби та її дослідженням у лабораторії перевищить 72 год., пробу необхідно тримати в морозильній камері при температурі -20 град. С. У такому випадку проби направляють в лабораторію замороженими з використанням холодових елементів чи з сухим льодом, що носить назву "зротнього холодового ланцюга". Якщо його не дотримуватися протягом усього часу транспортування, поліо- та інші ентеровіруси, що знаходяться в фекаліях, можуть інактивуватися. При транспортуванні зразків фекалій потрібно використовувати термоконтейнери, сумки та холодові елементи, що призначені тільки для клінічного матеріалу, вони ні в якому разі не можуть бути використані для вакцини. Лабораторію, до якої надсилають зразки, повинно бути попереджено про надходження матеріалу. У летальних випадках відбирають секційний матеріал - сегмент низхідної товстої кишки довжиною 3 - 5 см разом з вмістом, шматочки тканин з шийного та поперекового відділів спинного мозку, довгастого мозку, варолієвого моста (приблизно по 1 см). Матеріал заливають середовищем для транспортування вірусів. Це середовище складається з основного сольового розчину Хенкса, розведеного до pH 7,4 буфером НЕРЕS, з 0,2 % бичачого альбуміну. До середовища додають антибіотики - пеніцилін і стрептоміцин (або гентаміцин) і феноловий червоний, як індикатор. Середовище розливають по 2,5 мл у герметично закриті флакони і зберігають при 0 - +8 град. C. Концентрований розчин гентаміцину (1 г гентаміцину сульфату в 200 мл стерильного фосфатного сольового буферу) розливають по 5 мл і зберігають при -20 град. C. Для використання додають 1 мл цього розчину до 100 мл середовищ, щоб кінцева концентрація дорівнювала 30 - 50 мкг/мл. Додатково можна використовувати інші антибіотики: мікостатин фунгіцидної дії (25 ОД/мл), канаміцин та інші. Підготовка матеріалу до вірусологічних досліджень Половину зразка фекальних мас залишають при -20 град. C як резерв, необхідний для повторного вірусологічного дослідження. Другу половину використовують для виділення ентеровірусів, попередньо підготувавши суспензію освітлених фекальних мас. З цією метою ВООЗ рекомендує використовувати хлороформ. До флакону з керамічними (скляними) кульками додають 10 мл ФБР (фосфатно-буферного розчину). За допомогою шприця вносять 0,5 мл хлороформу і шпателем - 2 г фекалій, щоб отримати 20 % суспензію. Флакон енергійно струшують протягом 20 хв. та центрифугують 20 хв. при 1500 - 3000 об./хв. Переносять по 3 - 4 мл освітленої фекальної суспензії в 2 пробірки. Проби підписують і нумерують. Одну використовують для виділення вірусів, другу зберігають як запасну при -20 град. C. Для отримання суспензії освітлених фекальних мас можна використовувати і ефір за загальновживаною методикою. Виділення і ідентифікація ентеровірусів Паралельно інфікують по 2 пробірки з моношаром клітинних ліній HEp-2 та RD) (по 0,2 мл суспензії на кожну пробірку). По 2 пробірки з кожною лінією клітин залишають як контроль клітинних культур. Інкубують при 36 град. С. Моношар клітин мікроскопують щоденно, записуючи результати мікроскопування (цитопатогенну дію, яка може спричинятися як ентеровірусами, так і бути результатом токсичної дії фекальних мас на клітини). Проби, що викликали ЦПД у культурі клітин, заморожують при -20 град. C і розморожують, центрифугують, відбирають супернатант, який використовують для наступного пасажу з метою запобігання токсичній дії фекалій до початку серотипування. З матеріалом, що не дав ЦПД, або якщо після зараження фекальною суспензією клітини проявляють швидку (менш ніж за 24 години) дегенерацію через токсичність фекалій, необхідно зробити додаткові пасажі. Після виявлення цитопатогенного агенту проводять титрацію вірусів та ідентифікацію їх в реакції віруснейтралізації згідно з методиками, що описані вище. Термін дослідження клінічного матеріалу у вірусологічних лабораторіях областей 28 діб. Усі поліовіруси та інші ентеровіруси, виділені з клінічного матеріалу та об'єктів довкілля, протягом 7 діб після їх виділення та ідентифікації повинні бути нарочним доставлені до УРЛП для підтвердження правильності типування і наступного проведення внутрішньотипової диференціації. Щоквартально обласні лабораторії надсилають звіти до УРЛП за формами, що надаються (додаток 2). VI. Вірусологічні дослідження об'єктів навколишнього середовища Первинне розмноження ентеровірусів відбувається в ентероцитах тонкої кишки, звідки вони з фекальними масами потрапляють до довкілля, забруднюють грунт, воду, можливе їх надходження до молочних продуктів, овочів і фруктів. Значне накопичення ентеровірусів, включаючи поліовіруси, відбувається в тканинах молюсків, що фільтрують воду (устриці, мідії тощо). Здійснення вірусологічного моніторингу об'єктів довкілля необхідно для визначення інтенсивності циркуляції ентеровірусів на території, їх типового складу, наявності "диких" поліовірусів та оцінки ефективності роботи очисних споруд. Рекомендовані методи дослідження об'єктів довкілля: Вірусологічне дослідження води. Дослідження стічних вод, води, відкритих водоймищ, питної води здійснюють під час проведення попереджувального та поточного санітарного нагляду, а також за епідеміологічними показниками. У результаті дослідження стічних вод визначають рівні контамінації їх вірусами, типовий склад, його зміни протягом сезонів року та оцінюють ефективність роботи очисних споруд. Відкриті та підземні водоймища досліджують на наявність вірусів при виборі їх як джерел водопостачання, планово та за епідемічними показниками. Вірусологічні дослідження питної води здійснюють як планово, так і за епідеміологічними показаннями, погодивши з епідеміологом кратність і точки відбору зразків води. 1. Відбір проб води Проби відбирають у стерильний посуд, найбільш доцільно використовувати флакони з-під вірусологічних середовищ об'ємом 500 мл. Після відбору проб води флакони закривають гумовими стерильними корками і закріплюють лейкопластирем. В лабораторію проби доставляють у сумках-холодильниках чи пенопластових коробках з сухим льодом чи термоелементами. Термін доставки - до 6 годин від моменту відбору. В лабораторії вода підлягає дослідженню в перші години з моменту надходження. При необхідності її можна зберігати при +4 град. C протягом доби, а при -20 град. C і довше. Кратність вірусологічного контролю стічних вод за умов поточного санітарного нагляду складає 1 раз на місяць. Порівняльно досліджують проби води до і після очистки. Загальна кількість води для досліджень складає 500 мл. Відбір проб води поверхневих водоймищ здійснюють з мостів, помостів, плавзасобів, але в місцях, де глибина водоймищ не менше 0,5 м. Не рекомендується відбирати проби з берега. Воду в намічених місцях відбирають за допомогою барометра. Поверхневі проби відбирають з глибини 10 - 15 см від поверхні води, придонні - 30 - 50 см від дна. В зимовий період роблять ополонки, але таким чином, щоб у воду не потрапило забруднення з льоду чи інструментів. Посуд відкривають безпосередньо перед відбором. При дослідженні води з артезіанських свердловин проби відбирають після тривалої відкачки води до постійного динамічного рівня. Стерильні пляшки чи флакони заповнюють водою, щільно закривають стерильним корком. Загальний об'єм води для дослідження складає 3 літри. Проби питної води відбирають безпосередньо або через стерильні гумові шланги в скляний посуд об'ємом 10 - 20 л. При цьому водозабірній кран тричі обпалюють спиртовим факелом і воду спускають протягом 15 хв. Для дехлорування води в 10-літрові склянки до їх стерилізації вносять тіосульфат натрію з розрахунку 20 мг на 1 л води. Воду набирають у склянки з дехлоратором. Об'єм однієї проби води - 10 - 20 л. 2. Концентрація вірусів із води за допомогою бентоніту В основу принципу концентрації вірусів покладено їх здатність до адсорбції на частках бентоніту в кислому середовищі (pH 4,0 - 5,0) з подальшою елюцією в лужні розчини елюантів (pH 8,5 - 9,5). Елюції вірусів з бентоніту в лужному середовищі перешкоджають катіони. Тому комплекс вірус-бентоніт попередньо відмивають (знесолюють) дистильованою водою в кислому середовищі. На ефективність концентрації вірусів впливають: вміст органічних речовин у досліджуваних об'єктах, наявність дво-тривалентних катіонів, ступінь мікробного забруднення. 2.1. Концентрація вірусів із стічної води Якщо стічні води містять фекалії, побутові відходи та інші тверді частки, то воду попередньо слід звільнити від них. Для цього воду центрифугують при 1000 об./хв. протягом 15 хв. або фільтрують через паперовий або ватно-марлевий фільтри. Отриманий фільтрат використовують для наступної концентрації ентеровірусів. Слід відзначити, що під час попередньої обробки разом з твердими частками видаляється також частина ентеровірусів. Щоб це не позначилось на результатах дослідження, рекомендується здійснити додаткову десорбцію ентеровірусів з осаду стічних вод. Для цього до осаду додають 0,5 М фосфатний буфер (Na2HPO4, pH 8,0 - 8,3) в 0,88 M розчині NaCl у співвідношенні 1:2 - 1:3 (вага : об'єм). Суміш ретельно перемішують 5 - 10 хв., а потім центрифугують при 3500 об./хв. протягом 20 хв. Надосадову рідину використовують для дослідження. Концентрацію ентеровірусів із стічних вод здійснюють за такою схемою. Відбирають 500 мл стічної води, звільненої від твердих часток, додають NaCl до 0,1 М концентрації (6,0 г NaCl), 1,0 мл 5 % гелю бентоніту і по краплях та під контролем pH 1 M розчин MCl чи ацетатний буфер до pH 4,5 - 5,0 (гель бентоніту можна одержати в Українській референс-лабораторії з поліомієліту). В цих умовах при кислих значеннях pH відбувається адсорбція ентеровірусів на бентоніті. Вже через 4 - 5 хв. струшування матеріалу утворюється комплекс вірус-бентоніт, який осаджують центрифугуванням при 3000 об./хв. протягом 10 хв. При цьому на дні посуду, в якому здійснювали центрифугування, утворюється білий осад бентоніту в комплексі з адсорбованими на ньому вірусними частками. Для знесолювання комплексу вірус-бентоніт до осаду додають 15 - 20 мл дистильованої води і за допомогою піпетування та інтенсивного струшування переводять осад у гомогенну суспензію, яку переносять у центрифужний флакон і центрифугують при 3000 - 4000 об./хв. протягом 15 хв. Надосадову рідину видаляють. Осад використовують для елюції ентеровірусів. Для цього до осаду додають 2 - 3 мл 0,05 М розчину трисбуферу на дистильованій воді з pH 9,0 і інтенсивно струшують протягом 4 - 5 хв. Суспензію далі центрифугують при 4000 об./хв. протягом 15 - 20 хв. і прозору надосадову рідину відбирають піпеткою. Таким чином одержують елюат-1. Але повного звільнення ентеровірусів з поверхні часток бентоніту не відбувається. Тому до осаду знову додають 1,5 - 2 мл 0,05 M розчину трис-буферу і процедуру елюції повторюють. Елюат-2 об'єднують з елюатом-1 у стерильному флаконі. Отриманий вірусний концентрат, як правило, містить до 90 % вірусів від вихідної їх кількості. Тривалість усієї процедури концентрації - біля 1 години. Концентрат вірусів підлягає деконтамінації - звільненню від сторонньої мікрофлори. 2.2. Дослідження осаду стічних вод Зразки осаду стічних вод або активного мулу відбирають в стерильний посуд загальним об'ємом 0,5 л. Проби старанно перемішують, розливають у флакони по 250 мл і центрифугують при 1500 об./хв. протягом 20 хв. Для десорбції вірусів до кожного зразка додають елюючий розчин з розрахунку 1:2 - 1:10. Використовують суміш фосфатного буферу (pH 8,2) (1 частину) і м'ясопептонного бульону (9 частин). За допомогою 1 M розчину NaOH або 1 M розчину HCl встановлюють pH суміші в межах 8,6 - 8,8, проби струшують протягом 10 хв., а потім центрифугують при 3000 об./хв. протягом 30 хв. Більш ефективно десорбцію вірусів із осаду стічних вод або активного мулу здійснюють за допомогою 0,88 М розчину MaCl на 0,5 М розчині фосфатного буферу (Nа2РО4 - КН2РО4), що має показники pH 8,2 - 8,4. При цьому вдається десорбувати до 87 % від загальної кількості адсорбованих вірусних часток. Надосадову рідину використовують для концентрації вірусів за допомогою бентоніту за методом, що наведений в підрозділі "Концентрація вірусів із стічної води". 2.3. Концентрація вірусів із води поверхневих водоймищ До 1 л досліджуваної води додають 0,75 мл 5 % гелю бентоніту. Для інтенсифікації адсорбції ентеровірусів на бентоніті у воду вносять СаСl2 до 0,01 - 0,1 М концентрації. Показник pH суміші доводять до 4,5 - 5,0 за допомогою 1 M розчину НСl, який додають по краплях. Значення pH контролюють за допомогою pH-метру або індикаторного паперу. Суміш інтенсивно струшують 3 - 5 хв. При цьому утворюється комплекс вірус-бентоніт, що випадає в осад при низькошвидкісному центрифугуванні при 1000 - 1500 об./хв. протягом 20 хв. Надосадова рідина видаляється, а осад з метою знесолювання суспендують в 10 - 15 мл дистильованої води (pH 4,5). Потім суспензію центрифугують при 3000 - 4000 об./хв. протягом 15 хв. Елюцію вірусів з бентоніту здійснюють, як і в випадку з стічною водою, з використанням 0,05 M трис-буферу з pH 9,0. Отриманий елюат в об'ємі 3 - 5 мл дедаконтамінують від бактеріальної мікрофлори і використовують для виявлення ентеровірусів. 2.4. Концентрація вірусів із питної води До досліджуваної проби питної води в об'ємі 20 л додають 5 % гель бентоніту в кількості 5 мл. З метою інтенсифікації адсорбції ентеровірусів на бентоніті та прискорення седиментації осаду в досліджувану воду вносять стерильний розчин хлориду кальцію до 0,01 M концентрації. Суміш струшують 1 - 3 хв. Утворений комплекс вірус бентоніт осаджують або природним відстоюванням при 4 град. C протягом 14 - 18 годин, або низько-швидкісним центрифугуванням при 1000 - 1500 об./хв. протягом 20 - 30 хв. Надосадову рідину зливають. Після деконтамінації осад вносять безпосередньо в основу середовища для виявлення ентеровірусних бляшок, якою заливають моношари чутливих культур клітин. Через 48 годин після інкубації в термостаті при 36 град. C заражених моношарів культур клітин в них формуються вірусні бляшки, які характеризують кількісний вміст ентеровірусів в досліджуваній пробі води. Якщо бляшки не виявляються під бентонітовим покриттям, останнє використовують як вірусовмісний матеріал для подальшого дослідження. 3. Вірусологічне дослідження грунту Зразки грунту відбирають у стерильні флакони переважно з поверхневих шарів з глибини 0 - 20 см, інколи - з глибини 50 - 100 см для визначення процесів міграції вірусів у грунтові води. До наважки грунту в 5 г, яка міститься в стерильному флаконі об'ємом 100 мл, додають 50 мл 0,5 М розчину фосфатного буферу (pH 8,5) чи м'ясного екстракту на гліцериновому буфері (pH 9,5 - 10,0). Пробу грунту перемішують і інтенсивно струшують протягом 5 хв. Отриману суспензію грунту центрифугують при 3000 об./хв. протягом 10 - 15 хв. Концентрацію вірусів з надосадової рідини за допомогою бентоніта здійснюють за методикою, наведеною для стічних вод. 4. Вірусологічне дослідження продуктів харчування Здійснють за епідеміологічними показаннями при визначенні етіології захворювань людей з харчовим фактором передачі. Зразки рідких харчових продуктів (молоко, кефір тощо) в об'ємі 200 - 300 мл обробляють реагентами для видалення білків, ліпідів. З цією метою до проби продукту об'ємом 10 мл додають 0,3 г кристалічного натрію цитрату (Nа2С6Н5О7 5,5 Н2О). Після перемішування протягом 20 хв. на магнітній мішалці до проби додають 10 мл фреону-113 (відносна густина 1,36) і гомогенізують 2 хв. Суміш центрифугують при 3000 об./хв. протягом 30 хв. Надосадову рідину використовують для подальшої концентрації вірусів за допомогою бентоніту або поліетиленгліколю (ПЕГ-4000 або ПЕГ-6000). Напівтверді харчові продукти по 25 - 30 г піддають екстракції вірусів у рідині з лужними значеннями pH (0,5 M розчин фосфатного буферу, 0,1 M розчин гліколевого буферу) з наступним концентруванням вірусів за допомогою ПЕГ-4000 або ПЕГ-6000. Аналогічні дослідження проводять із зразками твердих харчових продуктів (овочами). Деконтамінацію вірусного концентрату здійснюють за допомогою ефіру або антибіотиків. Етиловий ефір використовують на проміжних і заключних етапах концентрації вірусів. Після центрифугування до осаду (вірус-бентоніт) вносять ефір у співвідношенні 1:5, суміш струшують і флакони під ватно-марлевими корками витримують у вакуумній камері при +4 град. C 18 - 24 години. Елюати доцільно обробляти ефіром у співвідношенні 1:1. Антибіотики до елюату додають із розрахунку: пеніцилін 200 - 1000 ОД/мл, стрептоміцин - 200 - 500 мкг/мл (в залежності від інтенсивності контамінації мікроорганізмами). Для досягнення максимального ефекту деконтамінації названі способи можна поєднувати.
2. Випадки ГВП Результати:
+ - Число виділених неполіомієлітних ентеровірусів. * - Поновлення результатів за попередній квартал ЕВ. ЕВ - Ентеровіруси. 3. Контакти** Результати:
+ - Число виділених неполіомієлітних ентеровірусів. * - Поновлення результатів за попередній квартал. ЕВ - Ентеровіруси. ** - Під словом контакт(и) маються на увазі особи, що безпосередньо спілкувалися з хворим. 4. Показники ефективності роботи Період часу між початком паралічу і відбором проб фекалій (вказати лише ті випадки, для яких відомі дати відбору проб і початку паралічу)
Період часу між початком паралічу і відбором проб фекалій (включати тільки ті проби фекалій, дата відбору яких відома)
5. Стан отриманих проб* Загальна кількість проб фекалій пацієнтів з ГВП та контактів
* - Критерії: наявність льоду у пробі, достатній об'єм, відсутність протікання, сухість проби. 6. Період часу між отриманням проби і відправленням звіту Загальна кількість проб фекалій пацієнтів з ГВП і контактів, що отримані протягом кварталу
* - Кількість проб фекалій, що отримані для дослідження протягом кварталу, але звіт по яких поки що не відправлений у зв'язку з відсутністю результатів дослідження. ** - Поновлення інформації про період часу, який пройшов між отриманням проб і відправленням звітів по пробах, що були отримані на протязі попереднього кварталу. Примітки/потреби
____________
|
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||